UA-Glo® Kinase ADP Max Assay Kit

UA-Glo激酶 ADP-Max检测试剂盒可以定量测定酶学实验中任何产生ADP的酶的活性，例如激酶或ATPase的活性。该试剂盒通过定量检测酶反应产物ADP的数量以确定酶的活性： ADP的数量和酶活性呈正相关。 使用UA-Glo 激酶 ADP-Max检测试剂盒时酶反应中的ATP浓度最高可至5mM。该试剂盒可以检测多数激酶，激酶底物包括多肽，蛋白，脂或糖等。该试剂盒可用于激酶/ATPase抑制物的高通量均相筛选，并可以通过调整ATP浓度区分ATP竞争性和非竞争性抑制物，而实验中应用高浓度ATP可以使某些激酶或ATPase的反应条件更接近于其生理反应条件。UA-Glo 激酶 ADP-Max检测试剂盒具有广泛的通用性，高检测灵敏度，检测动态范围大和不易受化合物干扰的优点。

激酶ADP-Max检测试剂盒由ATP Max去除试剂和ADP Max检测试剂两部分组成，并包括ATP和ADP试剂各一瓶。其中ATP Max去除试剂用于终止酶反应 , 同时去除ATP；ADP Max 检测试剂用于将 ADP 转换成 ATP ，并通过萤光素酶和ATP的反应产生光信号。试剂盒规格如下：

1.酶反应实验设定：以激酶反应为例

1)在96孔或384孔白不透明实验板中进行激酶反应。建议96孔板反应体积为25μL，384孔板反应体积为5μL。可以在激酶反应中加入浓度梯度的测试化合物。

2)激酶和底物浓度需要根据不同的激酶反应进行优化。在实验所需的适当信噪比的情况下，可以采用在信号线性反应范围的激酶浓度进行实验。由于UA-Glo激酶ADP-Max检测试剂盒的高度灵敏性，激酶用量可以极大降低。

3)激酶反应ATP的浓度最高可至5mM, 不低于0.5mM。对于ATP浓度低于0.5mM的激酶反应建议使用UA-Glo 激酶ADP检测试剂盒（目录号UA070101）以获得最优实验结果。一些市售ATP含有ADP残余，由于激酶ADP-Max检测试剂盒的高度灵敏性，ATP中的ADP残余会导致高实验背景，因此激酶反应需使用高纯度的 ATP。可以使用试剂盒自带ATP，或其他高纯度ATP，例如Sigma-Aldrich所售 ATP (Cat# A2383 , 纯度≥99%) 或其他更高纯度的ATP。

4)激酶反应可以在通用反应缓冲液中进行（40mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.1 mg/ml BSA, 20mM MgCl2）或采用文献报道的反应缓冲液和辅助因子。

5)激酶反应的温度和时间需根据不同激酶而设定。进行化合物高通量筛选实验时，建议优化激酶反应于室温（22℃-25℃）进行，以利于在激酶ADP-Max检测过程中保持实验板的温度均一性。

6)激酶反应结束后不需要加入额外试剂终止激酶反应。如果因特殊实验要求需要加入激酶反应终止试剂，避免使用镁离子螯合剂，例如EDTA。 激酶ADP-Max检测反应需要镁离子，最终镁离子的浓度必须至少为5mM。

2.激酶反应后ATP的去除

1)取出ATP Max去除试剂，平衡至室温（22℃-25℃）。轻摇混匀【注1 2 3】。

2)如果激酶反应是在非室温，例如30℃进行反应的，平衡实验板至室温【注4】。

3)加25 µL的ATP Max去除试剂到 以上25 µL 96-孔实验板中（总体积50µL）, 或5 µL ATP Max去除试剂到5 µL 384- 孔实验板中（总体积10µL）。振荡混匀【注5】。

4)室温孵育40分钟。

3.激酶活性测定（ADP检测）

1)取出ADP Max检测试剂，平衡至室温。轻摇混匀【注4】。

2)加50 µL的ADP Max检测试剂到 以上50 µL 96-孔实验板中, 或10 µL ADP Max检测试剂到以上10 µL 384- 孔实验板中，振荡混匀。室温暗处孵育30分钟。

3)可以在加入ADP Max 检测试剂后30-180分钟或更长时间读取发光信号【注6】。

1. 首次使用试剂后应分装并于-20℃及以下避光储存，保证试剂的稳定性。 ATP Max去除试剂和ADP Max检测试剂反复冻融3次信号强度和功能无损失，放置于4℃ 3天信号强度和功能无损失。

2. 长期保存于-20℃ 的ADP Max检测试剂解冻至室温可能会有少许沉淀，可以直接使用上清试剂或离心去除沉淀后使用。

3. 不同批次不建议混用。

4. ADP Max检测试剂中的荧光素酶反应对温度变化敏感。试剂和测试样品/实验板需要平衡到室温（22℃-25℃），测试过程温度保持恒定（±1℃）。

5. 非经验证，不建议改变反应试剂用量。激酶反应， ATP Max去除试剂和ADP Max检测试剂的体积比应为1：1：2。

6. 发光信号非常稳定，3hr内信号强度下降<20%。

7. 本产品仅作科研用途。