Biotin Labeling Efficiency Detection Kit (HABA Method)

检测原理

由于生物素（Biotin）对亲和素（Avidin）的亲和力较高，Biotin可取代4‘-羟基偶氮苯-2-羧酸（HABA）与亲和素的相互作用，使500nm 处的吸光度成比例降低，且吸光度的变化与生物素的含量相关。

若将生物素标记的蛋白溶液加入到HABA-Avidin的混合物中，通过测量HABA-Avidin溶液加入生物素样本前后的吸光度的变化，根据朗伯-比尔定律，可以推算溶液中存在的生物素的含量。

应用
配合生物素快速偶联试剂盒，用于评估生物素的标记效率。

优势
（1）可靠—经验证的成熟有效的检测方法
（2）便捷—试剂盒提供检测的全部试剂，包括酶标板
（3）灵活—自由选择分光光度计法或微孔板法进行检测

5T（分光光度计法）
24T（微孔板酶标仪法）

未提供的必需品：

具有500nm检测功能的分光光度计或酶标仪。

移液器20-1000µL。

试剂准备

1. 样品 : 在进行分析之前，生物素标记的蛋白质样品必须进行脱盐或透析，以去除所有未反应和水解的生物素偶联剂。

2. HABA-Avidin溶液配制：

1) 将480µL 试剂C磷酸盐缓冲液(PBS)加入试剂B 亲和素的管中，配制5.2mg/mL的亲和素溶液。

2) 请根据所用的测量方法（分光光度法/微孔酶标板法）计算所需的HABA-Avidin混合溶液的体积（分光光度法：900µL/测试；微孔酶标板法：180µL/孔），并按需配制。

3) 配制HABA-Avidin混合溶液：将138µL试剂A HABA溶液与460µL刚配制的亲和素溶液加入到4002µL 试剂C 磷酸盐缓冲液(PBS )中（也可根据需要等比例配制) ，混合均匀，得到HABA-Avidin混合溶液。

4) 该溶液在1cm比色皿中的500nm处的吸光度A500为0.9-1.3；

5) 该混合溶液在4°C下稳定两周。如果在HABA溶液中有沉淀，则可以过滤或离心后再使用；

根据需要选用分光光度法或者微孔酶标板法对标记体系在500nm处的吸光度进行测量

一、分光光度法

1. 在1cm 比色皿中加入 900µL HABA-Avidin溶液，并测量在500nm处吸光度 A1500

2. 向含有HABA-Avidin的比色皿中加入100µL生物素标记的蛋白样品，混合均匀。

3. 检测溶液在500nm处的吸光度，如果该值≥0.3，且数值保持恒定至少15秒钟，记录该值为 A2500。如果该值< 0.3，请稀释生物素标记的蛋白样品并重新测定，但后续计算处理时需考虑样本的稀释倍数。

偶联效率计算

根据朗伯-比尔定律（Beer-Lambert Law）：Aλ = ελbC， 其中：

A ：样品在特定波长(λ)处的吸光度。HABA测定的波长为500nm。

ε：波长(λ)处的吸光系数。对于500nm的HABA-亲和素混合物，pH 7.0时吸光系数为34000M-1cm-1 。

b : 液层厚度或光程长度，单位厘米(cm)。 1cm的比色皿的光程长度为1cm。

C : 样品的摩尔浓度 (mol/L = mmol/mL)。

可得出：

1. 计算蛋白的摩尔浓度：蛋白摩尔浓度（mmol/mL）=蛋白浓度（mg/mL）/ 蛋白摩尔质量（mg/mmol）

2. 计算混合溶液500nm处的吸光度变化 ∆A500 : ∆A500 = 0.9 × A1500-A2500

（注：0.9为校正因子，来自生物素标记蛋白溶液对HABA-Avidin混合液的稀释的调整）

3. 计算生物素摩尔浓度： Biotin（mmol/mL）= ∆A500 / 34000

（注：1cm 比色皿）

4. 计算生物素标记效率：

生物素 ：蛋白（摩尔比）=（生物素摩尔浓度（mmol/mL） × 10）/ （蛋白的摩尔浓度（mmol/mL） × 稀释倍数）

计算示例

若生物素标记的抗体分子量为150,000, 浓度为3.0mg/mL，A1500=1.0，A2500=0.56，

则：蛋白的摩尔浓度：3/150000=2*10-5 mmol/mL

500nm处的吸光度变化：∆A500= 0.9 ╳ 1.0-0.56=0.34

生物素摩尔浓度： 0.34/34000=1*10-5 mmol/mL

生物素：蛋白的摩尔比=1*10-5 ╳ 10 /（2*10-5） =5:1

二、微孔板酶标仪法

1. 在酶标微孔板中加入 180µL HABA-Avidin溶液，并测量在500nm处吸光度（A1500）

2. 向含有HABA-Avidin的孔中加入20µL生物素标记的蛋白样品，混合均匀。

3. 检测溶液在500nm处的吸光度。一旦该值保持恒定至少15秒，记录该值为 A2500。

偶联效率计算

根据朗伯-比尔定律（Beer-Lambert Law）：Aλ = ελbC， 其中：

A ：样品在特定波长(λ)处的吸光度。HABA测定的波长为500nm。

ε：波长(λ)处的吸光系数。对于500nm的HABA-亲和素混合物，pH 7.0时吸光系数为34000M-1cm-1 。

b : 液层厚度或光程长度，单位厘米(cm)。试剂盒中配备的组份D 微孔酶标板 200µL液体时的液层高度约为0.59cm，

C : 样品的摩尔浓度 (mol/L = mmol/mL)。

可得出：

1. 计算蛋白的摩尔浓度:蛋白摩尔浓度（mmol/mL）=蛋白浓度（mg/mL）/ 蛋白摩尔质量（mg/mmol）

2. 计算混合溶液500nm处的吸光度变化 ∆A500： ∆A500 = A1500-A2500

（注：微孔板则不需要校正因子，因为稀释效果正好被孔中溶液增加的高度和光程长度所抵消）

3. 计算生物素摩尔浓度:Biotin（mmol/mL）= ∆A500 /（34000 ╳ 0.59）

（注：试剂盒中配备的96孔酶标板的液面高度/光程长度为0.59cm）

4. 计算生物素标记效率：

生物素：蛋白（摩尔比）=（生物素摩尔浓度（mmol/mL）╳ 10）/（ 蛋白的摩尔浓度（mmol/mL） ╳ 稀释倍数）

计算示例

若生物素标记的抗体分子量为150,000, 浓度为3.0mg/mL，A1500=0.9，A2500=0.56，

则：蛋白的摩尔浓度：3/150000=2*10-5 mmol/mL

500nm处的吸光度变化： ∆A500= 0.9-0.56 = 0.34

生物素摩尔浓度：0.34 /（34000 ╳ 0.59）= 1.7*10-5 mmol/mL

生物素：蛋白 = 1.7*10-5 ╳ 10 /（2*10-5） =8.5 ：1