Extraction-free One-Step RT-qPCR Kit（Probe）

RT-qPCR 在基因表达检测及定量中使用极为广泛。传统的 RT-qPCR 虽然有一步法，但是涉及到样本 RNA 提取，过程繁杂，影响因素较多，检测通量很低。该试剂盒是免提取一步法 RT-qPCR 检测试剂盒，细胞洗涤后，直接加裂解液裂解，裂解液直接用作模版进行 RT-qPCR 扩增，从细胞准备到 PCR 结束可以在不到两小时的时间内完成，程序标准化，大大缩短了检测时间及影响因素，大大增加了检测通量。

本检测试剂盒为探针法（TaqMan probe）, 正式检测前 PCR 各参数需要先进行优化验证，以保证检测特异性及灵敏度。本检测试剂盒不包括 DNA 酶处理，因为 DNA 酶处理存在消化不完全的可能，残留 DNA 模板依然可能影响后期定量，同时 DNA 酶处理还存在灭活不完全的可能，残留 DNA 酶活性可能影响后期 PCR 扩增的 DNA 定量。因此，引物设计时需要以 RNA 序列为依据，扩增产品需要至少覆盖 2 个外显子，确保扩增系统不能以 DNA 为模板进行扩增，而只能以 RNA 为模板进行扩增。

该试剂盒由细胞裂解液 L 试剂，扩增缓冲液 B 试剂，扩增酶 mix E 试剂组成。具体规格如下：

1.细胞准备：待检测孔细胞需要在25至15000个细胞范围内。贴壁细胞吸去培养液后，用室温的DMEM无血清培养液洗涤一次，弃洗涤液后，加细胞裂解液。悬浮细胞离心吸去培养液后，用室温的DMEM无血清培养液洗涤一次，弃洗涤液后，加细胞裂解液。

2.细胞裂解：96孔培养板每孔加50μl L试剂，384孔培养板每孔加10μl L试剂，轻拍培养板数次，室温振摇10至15分钟。细胞裂解产物（lysate）使用完之后需要尽快放回2～8℃保存，低温保存时间不超过8小时。不建议长期保存细胞裂解产物。

3.RT-qPCR准备：按下列次序准备20μl 反应体系：10μl B试剂，4μl E试剂，2μl 引物探针mix，2μl 细胞裂解产物模板，2μl 无酶水。20μl 反应体系中细胞裂解产物不建议超过2μl 。

4.RT-qPCR扩增：逆转录42～50℃,20～30分钟，然后95℃1分钟。qPCR参数需要根据特定的目标基因及引物序列的预实验结果确定。以下是一个housekeeping基因的扩增设定，供参考：
逆转录：45℃，20分钟；然后95℃1分钟。
PCR扩增：94℃20秒，56℃20秒，65℃20秒（收集荧光信号），35～40个循环；然后72℃3分钟。

5.必要时进行熔解曲线分析。

6.结果分析。