Biotin (cleavable) Rapid Coupling Kit

生物素（Biotin，可切割）快速偶联试剂盒提供一个简单快速的偶联方案，用于将生物素衍生物（Biotin-S-S）偶联到含有游离氨基的抗体、蛋白质、多肽或者其它配体上。试剂在pH7-9的缓冲液中与伯氨基（-NH2）有效反应，形成稳定的酰胺键。蛋白质，包括抗体，通常在赖氨酸（K）残基的侧链和每个多肽的N末端具有几种伯胺，这些伯胺可用作试剂标记的靶标。该偶联剂在线性链中含有二硫基，使用DTT、BME和TCEP等还原剂，可以切割该连接体中的二硫键，从而去除生物素标记，为试剂提供了进一步的功能性。如：用于纯化抗体或蛋白，切割与链霉亲和素探针或的结合，也可作为一种可降解 (cleavable) 的 ADC linker，用于合成抗体偶联药物 (ADC)。

应用
（1）蛋白（抗体）等快速标记

优势
（1） 灵敏度高，标记效率高；
（2） 提供脱盐柱及使用方案；
（3） 提供标记效率检测方法；
（4）本试剂盒提供快速标记所需的全套试剂，且试剂易于保存。

2mg可用于标记0.5-2mg抗体（单抗，多抗）或其他蛋白：

10mg可用于标记0.5-10mg抗体（单抗，多抗）或其他蛋白：

2mg使用方法
1. 在待标记的抗体或蛋白中加入试剂A (待标记蛋白与试剂A的体积比为9:1），反复吹打混合均匀，避免产生气泡；
2. 将试剂C（50µL）加入到试剂B管中溶解混匀，配制5mg/mL偶联剂溶液（现配现用）；
3. 继续在步骤1的混合物中加入刚配制的偶联剂（每0.5mg蛋白/抗体中加入10µL偶联剂B溶液，若标记蛋白/抗体的量增加，可等比例提高加入的偶联剂量）吹打混合均匀，避免产生气泡；
4. 室温反应2个小时，也可在混匀仪上缓慢混匀；
5. 用蒸馏水或纯化水20倍稀释试剂D浓缩液，配制柱缓冲液与透析液。
6. 脱盐纯化：① 用试剂D的稀释液平衡脱盐柱，平衡体积30-40mL。②将偶联后蛋白/抗体用柱缓冲液补充体积到2.5mL，并加到脱盐柱中，任其流干，不收集滤过液。③再往脱盐柱中添加3.5mL柱缓冲液，同时收集滤过液3.5mL。
7. 透析（选做）：可选用试剂D稀释后配制的PBS透析液（10mM，pH7.2-7.4）或其他透析液，在2-8°C下透析反应混合物24-36小时，更换3-4次缓冲液。透析过程中，缓冲液应轻轻搅拌。
8. 裂解间隔臂中的二硫键：①还原剂配制：将试剂F（1mL）加入到试剂E管中溶解混匀，配制50mM TCEP.HCL还原剂溶液，pH 5.5, ②样本在室温下孵育30分钟。③也可将样品在50mM DTT或2-巯基乙醇中于室温下孵育2小时30分钟。

10mg使用方法
1. 在待标记的抗体或蛋白中加入试剂A (待标记蛋白与试剂A的体积比为9:1），反复吹打混合均匀，避免产生气泡；
2. 将试剂C（220µL）加入到试剂B管中溶解混匀，配制5mg/mL偶联剂溶液（现配现用）；
3. 继续在步骤1的混合物中加入刚配制的偶联剂（每0.5mg蛋白/抗体中加入10µL偶联剂B溶液，若标记蛋白/抗体的量增加，可等比例提高加入的偶联剂量）吹打混合均匀，避免产生气泡；
4. 室温反应2个小时，也可在混匀仪上缓慢混匀；
5. 用蒸馏水或纯化水20倍稀释试剂D浓缩液，配制柱缓冲液与透析液。
6. 脱盐纯化：① 用试剂D的稀释液平衡脱盐柱，平衡体积30-40mL。②将偶联后蛋白/抗体用柱缓冲液补充体积到2.5mL，并加到脱盐柱中，任其流干，不收集滤过液。③再往脱盐柱中添加3.5mL柱缓冲液，同时收集滤过液3.5mL。
7. 透析（选做）：可选用试剂D稀释后配制的PBS透析液（10mM，pH7.2-7.4）或其他透析液，在2-8°C下透析反应混合物24-36小时，更换3-4次缓冲液。透析过程中，缓冲液应轻轻搅拌。
8. 裂解间隔臂中的二硫键：①还原剂配制：将试剂F（2mL）加入到试剂E管中溶解混匀，配制50mM TCEP.HCL还原剂溶液，pH 5.5, ②样本在室温下孵育30分钟。③也可将样品在50mM DTT或2-巯基乙醇中于室温下孵育2小时30分钟。

重力脱盐柱的使用说明
1. 重力式脱盐柱的使用前准备
1). 取下脱盐柱顶盖并倒出柱储存溶液；
2). 在立柱底部处剪掉或切掉密封端。
2. 脱盐纯化
1). 用试剂D的20倍稀释液或其他缓冲液平衡脱盐柱，平衡体积35-40mL，丢弃洗脱液；
2). 将偶联后蛋白/抗体用柱缓冲液补充体积到2.5mL，并加到脱盐柱中，任其流干，不收集滤过液；
3). 再往脱盐柱中添加3.5mL柱缓冲液，同时收集滤过液3-3.5mL（可用EP管，每管收集1mL）；
3. 脱盐柱的工作条件与再生保存
1). 脱盐柱的工作条件： pH 2-13，4°C -30°C ；在常用缓冲液体（PBS、Tris-HCl、碳酸钠-碳酸氢钠等）中稳定；
2). 建议一次性使用（也可再生后重复使用）；
3). 脱盐柱的再生保存：过柱后，充分洗涤，用20%乙醇、0.05%NaN3或0.05mol/L NaOH保存柱子。

1. 待偶联的抗体/蛋白缓冲液及浓度要求：抗体/蛋白应保存于10mM的磷酸盐缓冲液（1xPBS，pH 7.2-7.4）中，推荐的浓度范围为2-4mg/mL，缓冲液中不能含有氨基成分，避免与偶联剂发生竞争反应，影响偶联效果：具体包括伯胺（如Tris、甘氨酸、铵盐、EDTA），及蛋白稳定剂（如BSA、明胶）等。若样本中含有可能干扰标记的物质，建议用PBS置换缓冲液，并浓缩至推荐浓度。

2. 对于大多数IgG，在1厘米光程的比色皿中，1mg/mL溶液在280nm处的吸光度约为1.3-1.4，偶联剂在280nm波长处没有明显吸收，因此，生物素标记抗体的浓度(mg/mL)可通过测量透析样品在280nm处的吸光度值除以1.4来计算标记抗体的浓度。

3. 建议偶联产物冷藏保存。如果纯化抗体/蛋白结合物的最终浓度小于1mg/mL，添加牛血清白蛋白(BSA)或其他蛋白稳定剂至浓度1-10mg/mL，可在2-8°C下稳定数月。对于长期储存，标记物溶液可按使用需求分装，并在-20°C下避光冷冻，避免反复冻融。

4. 本试剂盒中加入助溶剂后配制的偶联剂溶液，如果使用不完，请密封放在-20°C保存，一周内可以正常使用，如果超过一周，一个月之内使用，使用里量请酌情加大；超过一个月请不要再使用。

5. 对于分子量小于5KD的小肽分子，可适当提高偶联剂溶液的加样量，以提升偶联效率。

6. 本试剂盒中脱盐柱（>5000 Mr）的使用说明：柱体积8.3mL，洗脱液 3.5mL，重力脱盐：上样量1.0-2.5mL，脱盐效率>98%；离心脱盐：上样量1.75-2.5mL，脱盐效率>90%。

7. 试剂D于2°C -8°C保存有盐类结晶出现，恢复到室温并混匀后结晶消失属正常现象。