UniOne® TR-FRET KinActive-TK general Kit

UniOne® TR-FRET THUNDER™ KinActive-TK general Kit是一种采用均相时间分辨荧光技术（TR-FRET）测定酪氨酸激酶活性的通用方法，适用于多种酪氨酸激酶的活性检测及抑制剂筛选，该方法操作简单。

 如下图所示，检测方法包括酶促反应和检测两个步骤。在酶促反应过程中，体系成分包括激酶、生物素化底物以及ATP，加入ATP后，激酶将生物素化的TK底物磷酸化。在检测步骤中，用检测缓冲液稀释检测试剂，缓冲液中的EDTA将酶促反应终止，Eu标记抗体的抗体和链霉亲和素-BAc同时捕获被磷酸化的底物，结合在底物上的两种检测试剂产生的TR-FRET信号与底物磷酸化水平成正比，即与体系中激酶的磷酸化活性成正比。

【产品组分及储存条件】

注意：产品主要包括生物素化底物、检测试剂及缓冲液。缓冲液可保存在4℃，其他组分保存在-80℃。

添加成分（未提供）

试剂盒组分未包含EGFR激酶，酶促缓冲液用ddH₂O稀释至1×后，添加DTT, MgCl₂, MnCl₂配置成激酶缓冲液，推荐添加浓度1mM DTT, 5mM MgCl₂, 5mM MnCl₂。试剂盒未包含ATP，ATP的使用浓度需提前梯度稀释确定最佳使用浓度。

1、试剂准备

1.1 使用前将所有试剂室温融化（室温平衡至少30min）。384浅孔板反应体系为20μL（反应体系试剂用量如表所示），在配制之前计算实验所需体积，按需配制；以下配制仅供参考，以500次为例。

在酶促反应步骤中，各种试剂用配置的1× Enzymatic Buffer配置，检测试剂用提供的1× Detection Buffer配置。各种组分工作液配置后不建议保存，必须立即使用，为了避免降解，激酶工作液在实验过程中应保存在冰上。

1.2 待测样品（抑制剂）梯度稀释

用1× Enzymatic Buffer稀释化合物，根据抑制剂的一致效果确定稀释倍数和稀释梯度。

2.反应体系

如图所示，以384浅孔板为例，添加抑制剂、底物、激酶和ATP后在室温或37℃（酶促反应孵育温度时间需根据目标激酶优化）孵育30分钟（酶促反应体系中，建议DMSO浓度不高于2%），反应后加入检测试剂，检测缓冲液中的EDTA将酶促反应终止，室温孵育1h后上机读值。

实验应包括以下对照孔：

 （1）阴性对照：非特异性信号，用于计算反应体系的特异性信号值。

 （2）缓冲液对照：排除缓冲液对信号值的影响。

（3）Eu标记抗体对照：用于验证Eu标记抗体在620nM的正常信号值。

【检测】

在兼容的TR-FRET酶标仪上检测（激发光为320nm，检测620nm和665nm的发射波长）。

【结果计算】

1) Ratio：

Ratio = (665/620) ×10000

2) Net signal：

Net signal = (Std-NC)/NC×100

Std：the ratio of sample and control

NC: the ratio of negative control

3) CV（%）：

CV（%）= Standard Deviation/Mean Ratio × 100%

注：推荐微孔板（384孔板，白色，浅孔），货号：abs7311；

【激酶实验优化】

1)supplement component浓度优化

某些酪氨酸激酶可能需要在激酶缓冲液1X中添加supplement component试剂，以获得最佳酶活性。此步骤可确定最佳supplement component浓度——即使信号达到最大值80%时对应的浓度。制备一系列不同浓度supplement component的激酶缓冲液1X（建议范围从125 nM至0 nM）。

2)激酶浓度优化

本步骤主要为了确定最佳酶浓度（此时信号达到最大值的80%）。可在高检测信号与酶消耗之间寻求折衷方案。应使用固定浓度的TK-底物-生物素（如：1 µM）和ATP（如：100 µM），将酶进行梯度稀释并测试（建议酶浓度为10、2、1、0 ng/well，也可根据前期数据进行灵活调整）。让酶促反应进行30分钟。生物素/链霉亲和素比例建议为8:1。

3）动力学研究

酶动力学特性取决于激酶与底物的浓度。孵育时间研究需使用固定浓度的激酶（根据前次实验测定）、ATP（100 μM）及底物（1 µM）进行；通过在不同时间点加入检测试剂（1、2、5、10、30、60分钟），使反应在相应时间点终止。生物素与链霉亲和素的比例建议为8：1。

4）底物浓度优化

采用最佳酶浓度及饱和ATP浓度（100 µM）。建议测试不同TK底物-生物素浓度范围，其浓度梯度可从2 µM至1nM（两倍系列稀释）。激酶反应应在先前确定的最佳孵育时间点终止。在检测步骤中，需根据TK底物-生物素的浓度调整链霉亲和素的浓度，以确保生物素/链霉亲和素的比例始终维持在8:1，由于背景信号可能会随着链霉亲和素浓度的升高而升高，因此对每种链霉亲和素均需设置阴性对照。

5）ATP 浓度优化

本步骤优化ATP的使用浓度，需采用最佳酶浓度及饱和的TK底物浓度（1 µM）。建议测试ATP浓度范围为300 µM至1.7 nM（3倍梯度稀释）。在最佳孵育时间点，通过加入检测试剂终止激酶反应。生物素与链霉亲和素的比例建议为8：1。

6）Biotin/streptavidin 比率优化

优化生物素/链霉亲和素的比例是关键步骤，该步骤可显著增强信号强度。制备不同生物素/链霉亲和素比例（2/1、4/1、8/1）的链霉亲和素溶液；实验中采用最佳酶浓度、ATP浓度及底物浓度进行检测；同时，每种链霉亲和素浓度均需设置相应的阴性对照，因为该试剂会直接对背景值产生影响。

7）IC50 测定

需在广泛的抑制剂浓度范围内测试激酶活性，以绘制剂量反应曲线；该测试通常采用先前已确定的最佳检测条件进行。