UniOne® TR-FRET Human CRBN Ligand Screening Assay Kit

Catalog Number: UA086023 Brand: UA BIOSCIENCE

Price:

$2,180 USD

Size: 500T 100T 2500T 10000T

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Product Details

Product Specification

Host	Human
Stability & Storage	-80℃

Background

人Cereblon (CRBN) 蛋白配体结合检测试剂盒采用均相时间分辨荧光技术（TR-FRET），可用于CRBN抑制剂或配体的结合检测和筛选，是实现快速检测CRBN抑制剂或配体的高通量筛选形式，基本原理如下图所示。

Eu标记的检测试剂（Anti-Tag1-Eu）特异识别结合Tag1-CRBN/DDB1蛋白，受体标记的沙利度胺（Thalidomide-Ac）与CRBN结合，使Eu和Ac靠近，在外部光源的激发下，供体与受体之间发生能量共振转移，检测665nm波长的信号强度即可测定CRBN/DDB1与Thalidomide-Ac的结合。反应体系中加入的CRBN配体或PROTAC竞争结合CEBN/DDB1，使信号降低，配体或PROTAC浓度升高，信号降低。该均相实验操作简单，无需洗涤步骤。

Components

组分	浓度	100T	500T	2500T	10000T	储存温度
Thalidomide	10 mM in DMSO	5μL	5μL	25μL	100μL	-80℃
Tag1-CRBN/DDB1	100×	5μL	25μL	125μL	500μL	-80℃
Thalidomide-Ac	100×	5μL	25μL	125μL	500μL	-80℃
Anti-Tag1-Eu	50×	10μL	50μL	250μL	1000μL	-80℃
Detection buffer	10×	400μL	2mL	10mL	40mL	-80℃

注意：所有首次解冻后立即分装，并按建议储存温度保存，避免稀释后储存及反复冻融。

Protocol

1、试剂准备

1.1 使用前将所有试剂室温融化（室温平衡至少30min）。384浅孔板反应体系为20μL（反应体系试剂用量如表所示），在配制之前计算实验所需体积，按需配制；以下配制仅供参考，以500次为例。

表1. 试剂配制

试剂名称	配置	每个检测孔用量μL
Detection buffer	取2mL 10× Detection buffer加入18mL去离子水，稀释至1×，混匀备用。	-
标准品/待测样品稀释	使用稀释至1×的检测缓冲液进行待测样品和标准品的配制。若样品的储液为DMSO，建议保持体系中DMSO 含量一致，且最高不超过2%。标准品稀释见下表。	5
Tag1-CRBN/DDB1	取25μL Tag1-CRBN/DDB1原液，1× Detection buffer稀释至2.5mL ,混匀备用。	5
Thalidomide-Ac	取25μL Thalidomide-Ac原液，1×Detection buffer稀释至2.5mL ,混匀备用。	5
Anti-Tag1-Eu	取50μL Anti-Tag1 Eu 原液，加入 1×Detection buffer 2.45mL, 混匀备用。	5

1.2 标准品配置表

试剂盒中Thalidomide 标准品为10mM DMSO 母液。请根据实验情况配制标准品总量，以下内容仅供参考。

使用稀释至1×的检测缓冲液进行待测样品和标准品的配制。若样品的储液为DMSO，建议保持体系中DMSO 含量一致，(检测缓冲液中不含DMSO，请根据标准品或待测样品稀释情况向1×检测缓冲液中添加DMSO)且最高不超过2%。

表2. 标准品配置表

	Thalidomide配制浓度（nM）	Thalidomide浓度（nM）	配置方法
1	120000	30000	1μL 10mM 母液+82.3μL 1× Detection buffer
2	40000	10000	10μL ① +20μL 1× Detection buffer
3	13333.3	3333.33	10μL ② +20μL 1× Detection buffer
4	4444.4	1111.11	10μL ③ +20μL 1× Detection buffer
5	1481.5	370.37	10μL ④ +20μL 1× Detection buffer
6	493.8	123.46	10μL ⑤ +20μL 1× Detection buffer
7	164.6	41.15	10μL ⑥ +20μL 1× Detection buffer
8	54.9	13.72	10μL ⑦ +20μL 1× Detection buffer
9	18.3	4.57	10μL ⑧ +20μL 1× Detection buffer
10	6.1	1.52	10μL ⑨+20μL 1× Detection buffer
Blank	0	0	20μL 1× Detection buffer

	阳性药标曲	待测样本	阴性对照孔（NC）	Eu对照孔
第一步	5μL 梯度稀释Thalidomide	5μL 梯度稀释待测样本	5μL 1× Detection buffer	15μL 1× Detection buffer 加5μL 1×Anti-Tag1 Eu antibody
	5 μL Tag1-CRBN/DDB1
	封板，1000rpm，离心1min混匀，室温孵育10min
第二步	10μL Thalidomide-Ac + Anti-Tag1-Eu 1:1 Mix
	封板，1000rpm，离心1min混匀，室温孵育120min，读板

2、加样及对照

2.1 待测样本：5μL 梯度稀释待测样本，5μL Tag1-CRBN/DDB1工作液，5μL Thalidomide-Ac工作液，5μL Anti-Tag1-Eu工作液（Thalidomide-Ac可与Anti-Tag1-Eu按比例混合后加入），依次加入384浅孔板中。

2.2 阳性药标曲：5μL 梯度稀释Thalidomide，5μL Tag1-CRBN/DDB1工作液，5μL Thalidomide-Ac工作液，5μL Anti-Tag1-Eu工作液。

2.3 阴性对照孔（NC）：5μL 1× Detection buffer代替待测样本；

2.4 Eu对照孔：15μL 1× Detection buffer加5μL稀释后的Anti-Tag1 Eu antibody。

所有样本加完后，离心，盖封板膜，室温孵育2小时。

3、检测

在兼容TR-FRET的酶标仪上检测。激发光为320/340nm，检测620nm和665nm的发射波长。

【结果计算】

1) 计算信号值（Ratio）：665nm荧光信号比620nm荧光信号再乘10000。

Ratio = (665/620) ×10000

2) 计算CV（%）：

CV（%）= Standard Deviation/Mean Ratio × 100%

【数据示例】

以下数据不能代替实验中获得的数据，只作为示例，结果可能因读板仪器而异。

（1）标准曲线*

由图表可知，由于Thalidomide标准品与Thalidomide-Ac竞争与CRBN/DDB1的结合，使信号值降低。

（2）结合活性和抑制剂验证*

Thalidomide-Ac与CRBN/DDB1结合验证，由结果可知，蛋白浓度不变时，检测信号随着Thalidomide-Ac浓度的升高而增加。Lenalidomide和Pomalidomide以及PROTAC BET Degrader-1可以竞争Thalidomide-Ac与CRBN/DDB1的结合。

注：*数据仅做示例参考，推荐微孔板（384孔板，白色，浅孔）

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