小鼠脾脏细胞经分选后得到的Mouse T, CD4 T 和CD8 T经T Cell Activation/Expansion kit, mouse激活后培养7天；
T细胞完全培养基：RPMI1640基础培养基，添加10% FBS、50IU/mL IL2和50μM β-巯基乙醇；
接种密度：0.5×10⁶ / mL。
培养至第7天细胞扩增曲线。
T Cell Activation/Expansion Kit, mouse（RUO）
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Product Specification
| Stability & Storage | 避光保存于 2–8 ℃，不可冻存。 |
Background
Mouse T淋巴细胞是适应性免疫系统的核心效应细胞，主要分为CD4+辅助性T细胞与CD8+细胞毒性T细胞，在抗感染免疫、肿瘤免疫、免疫调节及自身免疫病发生过程中发挥关键作用。生理状态下，小鼠脾脏、淋巴结中的初始T细胞处于静息休眠状态，几乎不增殖、低表达功能分子，无法直接开展体外功能实验。因此，体外可控的T细胞活化与规模化扩增是小鼠免疫机制研究、细胞功能验证、免疫模型构建的核心基础技术；本试剂盒采用人工模拟抗原提呈细胞技术，通过生物素化CD3ε、CD28抗体偶联抗生物素磁珠，在体外精准复刻T细胞活化双信号，实现多克隆T细胞非特异性高效活化与扩增，适用于小鼠总T细胞、CD4 T、CD8 T细胞的批量扩增。磁珠作为固相载体，可同时富集大量CD3ε与CD28抗体，稳定结合T细胞表面对应受体，持续、均衡地提供第一信号与第二信号，规避天然抗原提呈的不稳定性，解决小鼠原代T细胞体外难活化、增殖弱的种属特异性问题，大幅提升活化效率与扩增倍数。
Protocol
1. 实验试剂
1.1 缓冲液：pH7.2 PBS 缓冲液，添加 2 mM EDTA，2–8℃预冷；禁止使用含钙、镁离子的缓冲液/培养基;
1.2 细胞培养基: RPMI 1640，添加 10% 胎牛血清（FBS）+IL-2（终浓度 30–100 IU/mL）;可选添加50-100 μM β-巯基乙醇，维持快速增殖状态下细胞活力;
2. 磁珠偶联（偶联 CD3ε/CD28 抗体）
磁珠不含防腐剂，分装操作全程无菌；建议单次偶联500μL磁珠，偶联后磁珠2–8℃可稳定保存3个月，无需洗去未结合抗体。
2.1 取 2 mL无菌离心管，加入 100 μL CD3ε-Biotin + 100 μL CD28-Biotin，充分吹打混匀；
2.2 加入300 μL 缓冲液（pH7.2 PBS含2 mM EDTA）混匀；
2.3 充分涡旋重悬磁珠，保证磁珠均匀分散；吸取 500 μL Streptavidin NanoBeads加入上述抗体混合液，总体积1 mL；
2.4 将离心管置于旋转架，2–8℃低速持续旋转孵育1 h；得到偶联的CD3ε/CD28的磁珠，后续可直接使用；
3. 实验步骤
所有操作全程无菌环境。
3.1 样本制备
脾脏来源静息小鼠T细胞活化扩增，制备淋巴器官（脾脏、淋巴结）单细胞悬液。可使用磁珠分选T细胞进行活化扩增：阳性分选 CD3/CD4/CD8 T 细胞：CD3ε Nanobeads Kit, mouse (RUO) (Cat. No. S0K0015); CD4 Nanobeads, Mouse (RUO) (Cat. No. S0K0003); CD8 Nanobeads, Mouse (RUO) (Cat. No. S0K0005); 阴性分选CD3 /CD4/CD8 T细胞：Mouse T Cell Isolation Kit (Cat. No. S0K1008/S0K3006); Mouse CD4 T Cell Isolation Kit (Cat. No. S0K1005/S0K3003); Mouse CD8 T Cell Isolation Kit (Cat. No. S0K1007/S0K3004).
具体操作参照对应产品说明书
3.2T 细胞活化与扩增操作
本方案基础体系适用于1×10⁶个分选后的T细胞对应20 μL偶联后的磁珠，细胞量翻倍时所有试剂体积同步放大。
3.2.1 取分选后的细胞按1×10⁶/mL重悬在新鲜完全培养基（RPMI1640 +10% FBS +30–100 IU/mL IL-2）中, 取1mL细胞至离心管中，充分混匀偶联磁珠，加入20 μL偶联的磁珠，400 g 离心7 min；（阴性对照：使用未偶联空白磁珠替代偶联磁珠；）
3.2.2 离心完，弃上清，沉淀重悬于1 mL新鲜完全培养基（RPMI1640 +10% FBS +30–100 IU/mL IL-2）,将细胞加入对应的孔板中培养，为保证最佳刺激与增殖效果，推荐使用铺板标密度：1×10⁶细胞 /cm²；
各培养板最优培养体系配比表
培养板型号 |
生长底面积 |
培养总体积 |
T 细胞接种数量 |
偶联磁珠的用量 |
96 孔板 |
0.31cm² |
0.2 mL |
0.25×10⁶ |
5 μL |
48 孔板 |
1 cm² |
1 mL |
1×10⁶ |
20 μL |
24 孔板 |
2 cm² |
2 mL |
2×10⁶ |
40 μL |
12 孔板 |
4 cm² |
4 mL |
4×10⁶ |
80 μL |
6 孔板 |
10 cm² |
5 mL |
5×10⁶ |
100 μL |
3.2.3 将培养板置于CO₂培养箱中培养，每日观察细胞状态，培养基不足及时补加；
3.2.4 培养至第2天，轻柔吹散细胞团块，此步可取样进行流式检测mouse CD25, mouse CD69看细胞激活情况;
3.2.5 传代扩增：每2天按 1:2 或 1:4 比例分瓶，补充新鲜培养基，增殖过快可缩短传代间隔;
3.2.6 二次刺激：活化培养 6–8 天后，T 细胞进入静息状态，如需持续扩增需再次加磁珠重刺激。
3.3 磁珠去除操作
若下游需进行磁珠分选、更换刺激抗原、刺激剂时，需提前去除磁珠：
3.3.1 收集细胞转移至 5/15/50 mL 离心管，缓冲液洗涤一次；
3.3.2 缓冲液重悬细胞，最高浓度 2×10⁷细胞/mL，充分吹散混匀；
3.3.3 将离心管固定于磁力分离器上，静置吸附10 min;
3.3.4 将细胞转移至新离心管，收集得到无磁珠的细胞，可开展后续实验。
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Validation Data
DLS
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