His Check Kit (HICA)
His Check Kit (HICA)
Product Details
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Product Specification
| Host | Human |
| Stability & Storage | -80℃ |
Background
本试剂盒采用双抗体夹心的均相化学发光法（Homogeneous Immuno Chemiluminescence Assay, HICA）进行细胞因子浓度的检测，操作简单，无需洗涤。
检测体系中包含两种微球：受体微球偶联针对His Tag抗体，供体微球偶联链霉亲和素。反应时，His Tag Protein与两个微球结合形成免疫复合物，使两种微球相互靠近。当供体微球与受体微球间距小于200 nm时，受光激发后产生的单线态氧可转移至受体微球并引发化学发光；当存在其他携带His Tag的蛋白时，与His Tag Protein竞争结合Anti-His Tag Acceptor Beads，供体微球与受体微球远离，则信号减弱，信号减弱与His Tag 蛋白浓度成比例。
通过检测化学发光信号强度，即可实现对目标蛋白的定量分析。该方法具有操作简便、反应快速、灵敏度高等特点。
Components
组分 |
浓度 |
100T |
500T |
2500T |
10000T |
储存温度 |
His Tag Protein |
20× |
25μL |
125μL |
625μL |
2500μL |
-80℃ |
Anti-His Tag Acceptor Beads |
200× |
5μL |
13μL |
65μL |
260μL |
2-8℃ |
Streptavidin Donor Beads |
125× |
5μL |
20μL |
100μL |
400μL |
2-8℃ |
Detection buffer |
1 × |
3ml |
15mL |
75mL |
300mL |
2-8℃ |
Protocol
1、试剂准备
1.1 使用前将所有试剂恢复到室温。384浅孔板反应体系为20μL（反应体系试剂用量如表所示），在配制之前计算实验所需体积，按需配制；以下配制仅供参考，以500次为例。
表2. 试剂配制
试剂名称 |
配置 |
每个检测孔用量μL |
His Tag Protein |
取125μL 20 × His Tag Protein原液，加入到2.375mL 1×Detection buffer稀释至1×，混匀备用。 |
5μL |
Anti-His Tag Acceptor Beads |
取13μL 200 × Anti-His Tag Acceptor Beads，加入到2.4mL 1×Detection buffer稀释至1×，混匀备用。 |
5μL |
Streptavidin Donor Beads |
取20μL 125 × Streptavidin Donor Beads，加入到2.480mL 1×Detection buffer稀释至1×，混匀备用。 |
5μL |
1.2 待测样品梯度稀释
以His Tag Protein 1为例，稀释液为1× Detection buffer，为降低基质效应干扰的影响，推荐使用与待测样品基质相同的溶液稀释；且待测样本根据实际浓度调整。
表3. 待测蛋白His Tag Protein 1梯度稀释（根据实际情况调整）
His Tag Protein 1配制浓度（nM） |
配置方法 |
|
① |
4000 |
4μL 50μM His Tag Protein 1母液+56μL 1× Detection buffer |
② |
800 |
10μL ① +40μL 1× Detection buffer |
③ |
160 |
10μL ② +40μL 1× Detection buffer |
④ |
32 |
10μL ③ +40μL 1× Detection buffer |
⑤ |
6.4 |
10μL ④ +40μL 1× Detection buffer |
⑥ |
1.28 |
10μL ⑤ +40μL 1× Detection buffer |
⑦ |
0.256 |
10μL ⑥ +40μL 1× Detection buffer |
⑧ |
0.0512 |
10μL ⑦ +40μL 1× Detection buffer |
⑨ |
0.01024 |
10μL ⑧ +40μL 1× Detection buffer |
Blank |
0 |
40μL 1× Detection buffer |
注：不同His Tag Protein会因为分子量和His Tag的个数不同，竞争结合Anti-His Tag Acceptor Beads的能力也不同，在正式实验之前需调整细胞数量或待测量的His Tag Protein的浓度，确保可以做出完整S曲线。
2、加样流程
检测流程 |
检测流程1 (37℃快速检测) |
检测流程2 (室温检测) |
第一步： |
依次加入5µL样品，5μLAnti-His Tag Acceptor Beads |
依次加入5µL样品，5μLAnti-His Tag Acceptor Beads |
孵育 |
400r/min震荡混匀1min，37℃孵育15分钟 |
400r/min震荡混匀1min，室温孵育60分钟 |
第二步： |
加入5µL His Tag Protein，5µL Donor Beads，避光/绿光 |
加入5µL His Tag Protein，5µL Donor Beads，避光/绿光 |
孵育 |
400r/min震荡混匀1min，37℃孵育10分钟，避光/绿光 |
400r/min震荡混匀1min，室温孵育30分钟，避光/绿光 |
读数 |
仪器读数，避光/绿光 |
仪器读数，避光/绿光 |
【数据展示】
以下数据不能代替实验中获得的数据，只作为示例，结果可能因读板仪器而异。
1.His Tag Protein夹心实验
2.不同His Tag蛋白测试结果
注：推荐微孔板（384孔板，白色，浅孔）
