UniOne® TR-FRET KinActive-BTK Kit

Catalog Number: UA086160 Brand: UA BIOSCIENCE

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$0 USD

Size: 100T 500T 2500T 10000T

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Product Details

Product Specification

Host	Human
Stability & Storage	-80℃

Background

TR-FRET KinActive-BTK Kit是一种采用均相时间分辨荧光技术（TR-FRET）测定布鲁顿氏酪氨酸激酶（BTK激酶）活性的方法，适用于BTK激酶的活性检测及抑制剂筛选，该方法操作简单。

如下图所示，检测方法包括酶促反应和检测两个步骤。在酶促反应过程中，体系成分包括激酶、生物素化底物以及ATP，加入ATP后，激酶将生物素化的BTK底物磷酸化。在检测步骤中，用检测缓冲液稀释检测试剂，缓冲液中的EDTA将酶促反应终止，Eu标记抗体的抗体和链霉亲和素-BAc同时捕获被磷酸化的底物，结合在底物上的两种检测试剂产生的TR-FRET信号与底物磷酸化水平成正比，即与体系中激酶的磷酸化活性成正比。

Components

【产品组分及储存条件】

试剂名称	浓度	100T	500T	2500T	10000T
BTK Substrate	20×	10μL	50μL	250μL	1mL
BTK	4.96μM	5μL	25μL	125μL	500μL
SA-BAc	25×	20μL	100μL	500μL	2mL
BTK-Antibody-Eu	25×	20μL	100μL	500μL	2mL
supplement component	400nM	20μL	100μL	500μL	2mL
5× Enzymatic Buffer	5×	0.4mL	2mL	10mL	40mL
1× Detection Buffer	1×	2mL	10mL	50mL	200mL

注意：产品主要包括生物素化底物、检测试剂及缓冲液。缓冲液可保存在4℃，其他组分保存在-80℃。

添加成分（未提供）

试剂盒组分未包含酶促缓冲液用ddH₂O稀释至1×后，添加DTT, MgCl₂, MnCl₂配置成激酶缓冲液，推荐添加浓度1mM DTT, 5mM MgCl₂, 5mM MnCl₂。试剂盒未包含ATP，ATP的使用浓度需提前梯度稀释确定最佳使用浓度。

Protocol

【实验流程及操作】

1、试剂准备

1.1 使用前将所有试剂室温融化（室温平衡至少30min）。384浅孔板反应体系为20μL（反应体系试剂用量如表所示），在配制之前计算实验所需体积，按需配制；以下配制仅供参考，以500次为例。

在酶促反应步骤中，各种试剂用配置的1× Enzymatic Buffer配置，检测试剂用提供的1× Detection Buffer配置。各种组分工作液配置后不建议保存，必须立即使用，为了避免降解，激酶工作液在实验过程中应保存在冰上。

组分	配置方法
1× Enzymatic Buffer	用ddH2O将5×Enzymatic Buffer稀释至1×，添加supplement component (终浓度4 nM) ，DTT，MgCl₂, MnCl₂配置成1× 激酶缓冲液。
1× Detection Buffer	1× Detection Buffer
抑制剂	用1× Enzymatic Buffer稀释化合物，稀释为酶促步骤(10 μL)所需终浓度的2.5倍的工作溶液。
BTK激酶	用1× Enzymatic Buffer稀释,配置浓度为5μM的工作液。
BTK Substrate	用1× Enzymatic Buffer稀释BTK Substrate原液，配置5×BTK Substrate工作液，该工作液浓度为酶促反应步骤所需 BTK Substrate 终浓度的 5 倍。
ATP	用1× Enzymatic Buffer稀释ATP原液，配制5×ATP 工作液；该工作液浓度为酶促反应步骤所需 ATP 终浓度的 5 倍。（ATP使用浓度需提前梯度稀释，确定最佳使用浓度）
SA-BAc	用1× Detection Buffer按照稀释倍数稀释至1×即为工作液。
BTK-Antibody-Eu	用1× Detection Buffer按照稀释倍数稀释至1×即为工作液。

1.2 待测样品（抑制剂）梯度稀释

用1× Enzymatic Buffer稀释化合物，根据抑制剂的一致效果确定稀释倍数和稀释梯度。

2.反应体系

如图所示，以384浅孔板为例，添加抑制剂、底物、激酶和ATP后在室温或37℃（酶促反应孵育温度时间需根据目标激酶优化）孵育30分钟（酶促反应体系中，建议DMSO浓度不高于2%），反应后加入检测试剂，检测缓冲液中的EDTA将酶促反应终止，室温孵育1h后上机读值。

实验应包括以下对照孔：

（1）阴性对照：非特异性信号，用于计算反应体系的特异性信号值。

（2）缓冲液对照：排除缓冲液对信号值的影响。

（3）Eu标记抗体对照：用于验证Eu标记抗体在620nM的正常信号值。

	酶促反应	对照
组分	实验孔	阴性对照	Eu标记抗体	缓冲液
抑制剂/激酶缓冲液	4μL	4μL 1× Enzymatic Buffer	10μL 1× Enzymatic Buffer	10μL 1× Enzymatic Buffer	1.酶促反应(10μL)室温或37℃孵育30min。
BTK	2μL	2μL
BTK Substrate	2μL	2μL 1× Enzymatic Buffer
ATP	2μL	2μL
SA-BAc	5μL	5μL	5μL 1× Detection Buffer	10μL 1× Detection Buffer	2.检测步骤(10μL)室温孵育1h。
Eu标记抗体	5μL	5μL	5μL	10μL 1× Detection Buffer	2.检测步骤(10μL)室温孵育1h。

【检测】

在兼容的TR-FRET酶标仪上检测（激发光为320nm，检测620nm和665nm的发射波长）。

【结果计算】

1) 计算信号值（Ratio）：665nm荧光信号比620nm荧光信号再乘10000。

Ratio = (665/620) ×10000

2) 根据信号值计算Net signal：

Net signal = (Std-NC)/NC×100

3) 计算CV（%）：

CV（%）= Standard Deviation/Mean Ratio × 100%

【结果展示】

1）激酶活性测试

注：推荐微孔板（384孔板，白色，浅孔）

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